Home

Navigation
Username

Password

Remember me
Password Reminder
Popular

 
| Home | How-to | Info | Tools |

 
 
substrates and uncouplers (in Russ.) Print E-mail

О комбинациях субстратов для дыхания митохондрий, разобщителях, и так далее.

  Выдержка из письма Др. Старкова кому-то из студентов.

 Download О субстратах и разобщителях.pdf
File Size:171.15Kb
 

Стандартные комбинации субстратов:

  •  Пируват с малатом 5:2 или 5:5 мМ;
  • Малат с глутаматом 5:1 или 5:5 мМ;
  • Сукцинат с ротеноном (не рекомендую для дыхания; ячейку полярографа от ротенона практически невозможно отмыть, особенно если в ней присутствуют пластиковые части в контакте с средо инкубации. Поэтому на НАД-зависимых субстратах данные после сукцината с ротеноном воспроизводиться будут плохо, если вообще). Вместо ротенона я использую глутамат; сукцинат:глутамат 5:1.

 Пируват с малатом НАД-зависимые субстраты. При окислении этих субстратов в цикле трикарбоновых кислот (ЦТК) в матриксе митохондрий вырабатывается НАДН. Он окисляется Комплексом 1 дыхательной цепи. При этом достигается максимальная эффективность окислительного фосфорилирования, потому что при окислении НАДН Комплексом 1 электроны проходят через три протонные помпы Комплекс 1, Комплекс 3, и цитохром ц оксидазу, а также потому, что траспорт малата через внутреннюю мембрану митохондрий не-энергозависим (в отличие от транспорта глутамата).

 Малат с глутаматом тоже НАД-зависимые субстраты. Иногда использование этой комбинации субстратов дает более высокую макисмальную скорость дыхания, чем использование пирувата с малатом. Одна из причин этого в том, что довольно часто происходит частичное ингибирование пируватдегидрогеназы при выделении митохондрий.

 Сукцинат ФАД-зависимый субстрат. При его окислении в ЦТК образуется ФАДН (связан в Комплексе 2 дызательной цепи). Образование НАДН обычно не произходит, хотя при этом НАДН и не расходуется. Причина этого в том, что сукцинат окисляется в фумарат, который конвертируется фумаратдегидрогеназой в малат. Малат мог бы окисляться малатдегидрогеназой (с продукцией НАДН), но этого практически не происходит, так как полученный из фумарата в матриксе митохондрий малат обменивается с экзогенным сукцинатом, при помощи дикарбоксилатного обменника. Окисление сукцината менее эффективно, чем окисление НАД-зависимых субстратов, потому что электроны проходят только через 2 протонные помпы Комплех 3 и цитохром ц оксидазу.

 

Зачем нужно добавлять ротенон при использовании сукцината в качестве субстрата окисления. При окислении сукцината в ЦТК образуется малат и далее оксалоацетат. В митохондриях животных переносчика оксалоацетата во внутренней мембране или нет, или он имеет очень низкую активность. С другой стороны, окисляться далее в цикле трикарбоновых кислот малат не может из-за отсутствия ацетил-КоА (он образуется из пирувата, который в такой постановке эксперимента не добавляется). Поэтому при окислении сукцината, оксалоацетат накапливается в матриксе. Оксалоацетат является сильным конкурентным ингибитором сукцинатдегидрогеназы, с намного более высоким сродством к ферменту, чем у сукцината. В силу этого, окисление сукцината без ротенона (или без глутамата, см ниже) приводит к быстрому ингибированию дыхания митохондрий, иногда в течение 1-2 минут. Оксалоацетат является продуктом окисления малата малтдегидрогеназой. Равновесие в этой реакция сильно сдвинуто влево (в сторону образования малата из оксалоацетата и окисления НАДН), и единственное почему окисление малата до оксалоацетата вообще возможно, это из-за быстрого использования оксалоацетата в ЦТК и наличия НАД+ он тянет реакцию в сторону окисления малата и продукции оксалоацетата. В свою очередь, НАД+ образуется путем окисления НАДН Комплексом 1 дыхательной цепи, который ингибируется ротеноном. Поэтому при окислении сукцината в присутствии ротенона оксалоацетат не образуется  - нет НАД+ - и ингибирования дыхания на уровне сукцинатдегидрогеназы не происходит. Для этого и добавляют ротенон, чтобы предотвратить ингибироеание сукцинатдегидрогеназы оксалоацетатом.

 

Почему можно (и нужно, и даже лучше) использовать глутамат вместо ротенона, при окислении сукцината?

 Предотвратить ингибирование сукцинатдегидрогеназы можно, если достаточно быстро убирать образующийся оксалоацетат. Для этого можно добавить глутамат вместе с сукцинатом. В митохондриях всех животных тканей присутствует активный переносчик глутамата. Также, в матриксе присутствует очень активный фермент аспартатаминотрансфераза, которая трансаминирует глутамат с оксалоацетатом с продукцией альфа-кетоглутарата и аспартата. Они не накапливаются в митохондриях, так как как для них есть активные трансмембранные переносчики. Поэтому при дыхании на сукцинате с глутаматом накопления оксалоацетата и ингибирования сукцинатдегидрогеназы не происходит, и ротенон не нужен. А окисления альфа-кетоглутарата (НАД-зависимый субстрат) в данных условиях не происходит, потому что альфа-кетоглутаратдегидрогеназа имеет довольно низкую активность по сравнению с сукцинатдегидрогеназой, и окисляется в таких условиях преимущественно сукцинат.

 Почему не надо использовать пируват с глутаматом? Это не оптимально потому, что окисление пирувата до ацетил-КоА дает одну молекулу НАДН, а для того чтобы получить еще две в цикле трикарбоновых кислот, нужет оксалоацетат. Оксалоацетат, как я упомянул выше, образуется при окислении малата. С другой стороны, глутамат эффективно убирает оксалоацетат через реакцию трансаминирования. Поэтому если хочется иметь хорошие скорости дыхания и эффективное фосфорилирование при окислении пирувата, надо добавлять к пирувату малат, а не глутамат. При этом будет работать весь ЦТК, и при окислении пирувата будет образовываться 3 молекулы НАДН, а не одна.

 О пирувате, разобщителях, и скорости дыхания. Максимальная скорость дыхания митохондрий в условиях совершения работы (например, при фосфорилировании добавленного АДФ) или разобщения (добавлен разобщитель-протонофор) определяется в основном двумя параметрами, а именно активностью дыхательной цепи и активностью первичной дегидрогеназы, которая поставляет субстрат для дыхательной цепи (НАДН, если субстраты НАД- зависимые, как пируват с малатом; или ФАДН, если окисляется сукцинат или жирные кислоты или альфаглицерофосфат). В большинстве животных тканей активность дыхательной цепи не является скорость-лимитирующим фактором при дыхании. Таковым является активность первичных дегидрогеназ (и/или активность трансмембранных переносчиков субстратов). В случае пирувата известно, что пируватдегидрогеназа активируется АДФ. Она активируется быстро в полуминутной шкале и значительно, в некоторых тканях в 5-10 раз (мышцы животных, типично в 5 раз, печень в 2 раза, мышцы насекомых в 10 и более раз). Поэтому, когда при окислении пирувата добавляется АДФ, обычно достигается максимально возможная скорость дыхания, за счет активации пируватдегидрогеназы. Это не так в случае с активацией дыхания разобщителем, потому что он не стимулирует собственно пируватдегидрогеназу.

В смешанном случае, когда сначала дается АДФ (и активируется пируватдегидрогеназа), а потом разобщитель, результат с разобщителем будет зависеть от степени активации пируват дегидрогеназы. То есть, можно получить как и скорость дыхания, равную таковой в присутствии АДФ, так и (часто) меньшую. Сделать тут практически ничего нельзя, кроме как перейти на другой субстрат, дегидрогеназа которого не активируется АДФ (глутамат, или сукцинат). К тому же, разобщители (все которые мне известны) начиная с некоторой концентрации ингибируют дыхательную цепь (на уровне Комплекса 3, обычно; а иногда препятствуя транспорту субстратов, как в случае глутамата и сукцината). Поэтому рекомендуется титровать разобщитель для получения максимальной скорости дыхания.

 

Last Updated ( Saturday, 03 May 2014 )
 

Latest News
MitoWorld



 
 
    Copyright 2004 - 2005  OXPHOS  International Pty Ltd. All rights reserved.   Vizitors: